答：制备单细胞悬液时，首先要看样本类型：针对已经处于悬浮状态的细胞、磁珠富集的细胞或流式分选的细胞，只需要进行清洗和计数；但在处理组织类样本时，必须首先通过机械法或酶解法进行解离，为了达到最佳的处理效果，需要对实验方法进行多次优化。 目前寻因生物的实验团队，已完成单细胞项目500+，有8000+的组织解离经验，并基于此对各类型组织做了难度归档和注意事项，在单细胞测序行业内属于top1 级别。


答：取样注意事项如下： 1.在取样时（尤其是病变组织）尽量避免取到坏死、钙化、硬化、纤维化的部位； 2.如手术为电刀切割组织，去除因与电刀接触的坏死组织； 3.确保目标组织术时无冰冻； 4.在取样后可对组织进行修剪，尽可能快速去除非目标部位然后尽快放入组织保存液中，以免影响最终测序结果。 5.消化系统组织需多用PBS或者生理盐水多次冲洗。 6.如是高龄动物标本请尽快送实验室进行解离。 7.实验模型是否会对细胞有影响，如小鼠肺部打入二氧化硅颗粒后，二氧化硅密度和细胞类似，后续无法去除干净。 8.药物治疗是否会对细胞有影响，如肿瘤治疗后，大部分肿瘤细胞凋亡后形成的碎片不易与细胞区分，影响细胞质检有核率。；


答：样本运输注意事项如下： 1.所有样品寄出前需将样品名称，取样时间，以及组织类型在管壁上标记清晰 2.所有样品寄出前后需告知本公司业务员，并及时填写电子版需求单以及快递单号，便于实验室接受样品并安排实验 3.如是传染性样品，请务必提前告知本公司业务员 4.提前与寻因生物业务员联系，获取组织保存液（或自备保存液：MACS Tissue Storage Solution，美天旎，货号130-100-008），标准为1.5mL/样本，如组织较大可申请使用5ml/样品保存液。切取约200mg的组织（黄豆粒大小），如组织较多，可取2-3份备用或申请5ml装。 5.将获得的组织用PBS或生理盐水洗掉组织中的血液。 6.将洗后的组织样本放入加满组织保存液的1mL（或者更大）保存管中。 7.将保存管用封口膜密封好，放入合适的泡沫盒中，并在泡沫盒子中放2~3个-20℃冷冻过的生物冰袋，将泡沫盒封好。 8.联系快递公司邮寄。邮寄前请提前联系公司工作人员，以免样本到达公司无人处理。要求组织样本在48h内到公司。


答：可以使用台盼蓝染色，用显微镜观察计数。原理是由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，可以阻拦台盼蓝，因而不被染色。死细胞的细胞膜通透性较大，因此可被台盼蓝染成蓝色。具体步骤如下： 1、20ul单细胞悬液与20ul台盼蓝混匀； 2、吸取20ul加入改好盖玻片的细胞计数板； 3、显微镜下观察统计细胞数量和颜色，死细胞浅蓝色，无光泽，活细胞不着色正常形态，有光泽； 4、统计一个视野内计数区细胞总数和死细胞数，按公式计算出细胞浓度、总量和活性。可多个视野取平均值。 也可以使用细胞自动计数仪检测细胞数目和活性，例如Countstar系列。其原理为使用 Countstar Rigel S2 系统，通过吖啶橙和碘化丙啶细胞核核酸结合的荧光染料AOPI。AO 可以穿透活细胞和死细胞对细胞核进行染色并发出绿 色荧光，PI 进入死细胞对细胞和进行染色并发出红色荧光。因此AO/PI 为细胞核染料， 可以准确区分活细胞与死细胞，而且可以排除杂质或者非特异细胞的干扰，进行精准的浓度活率检测。


答：如果组织内包含一些自发色的细胞，比如脉络膜或者黑色素瘤组织的某些黑色的细胞，就没办法通过自动计数仪进行荧光计数了。这种情况就需要操作人员通过显微镜观察细胞膜的完整性来判断细胞活性大小。